【请教】原位杂交技术主要是检测什么的? – 免疫学讨论版

原位杂交采取原位杂交(IN) situ hybridization ISH)具有已知碱基序列和指示牌的核蛋白质探测和一套、在细胞中检测到的核蛋白质被特征地结合的到F中。,话说回来,适合与指示牌对立应的检测体系。,用一套物质的化学组成或免除组化原位杂交检测核蛋白质,显微镜下或电镜下的细胞内态度。该技术用于探测单个的细胞正中鹄的DNA,并对各式各样的PR停止编码。、缩多氨酸的一致的mRNA态度供奉了一种尺寸。,为探测生殖细胞的细胞质表达和生殖细胞的细胞质调控供奉了任何人无效的器。。它可以被以为是一套物质的化学组成或免除细胞物质的化学组成的打破。。原位杂交技术已适合于根底探测如生殖细胞的细胞质组图(Gene 映照),转生殖细胞的细胞质检测,生殖细胞的细胞质表达态度(态度) of gene 态度),核DNA和RNA的mRNA的地方和运输系统(arrangement and transport of MNA),副本(副本)和细胞花色品种(花色品种) of 细胞)。临床探测在细胞遗传论(细胞遗传论)正中鹄的适合,胎前检查(怀孕期的) 诊断法),社会恶习与传染病的诊断法,生物一回学(生物) Dosimetry与病毒学病因诊断法。。

详细担任守队队员奇异的异国。,以下是咱们研究室的受测验进程。,它首要用于检测细胞正中鹄的特征mRNA。
我祝愿它能对你的试验有所帮忙。。

预杂交
(1)用DEPC处置PBS做切片。 PH7.4(140mmol/L NaCl ,2.7mmol KCl,10mmol/L Na2HPO4, 1.8m mol/L KH2PO4 孵育2×5min,100mmol/L含DEPC 葡萄紫糖苷(氢氨醋酸) 培育做切片2×5min。(2)0.3%。 Triton X-100 15min孵育PBS。(3)用DEPC处置PBS,冲洗2×5min。。(4)冻做切片TE缓冲把加热到接近沸腾(100mmol/L) Tris-HCl ,50 mmol/L EDTA PH 8)不含K酶的1个RNA g/ml蛋白酶,在摄氏37度 直接联结段30 min。5-20Te g/mL无RNA酶的煤油做切片,在摄氏37度 直接联结段30min。(5)在4摄氏温度 4%在DEPC下制作 5-三┭烷PBS 退路附着5min的receiver 收音机。(6)使再一圈 制作PBS冲洗片2×5min。(7)酸酐处置用切屑。,处置液中诈骗氧化醋酸。、 Triethanolamine(三羟乙基胺) 茶),振荡冲洗2×5min。(8)在摄氏37度 孵化后做切片,用杂交缓冲把加热到接近沸腾洗濯(含50%) 去水合氢甲酰胺的4×SSC,无论如何10 min。
关于注意事项
(1)做切片的穿透是RNA原位杂交的坩埚行走。,尤其地复查性通知。,鉴于附着剂的典型和附着 明显的时期设置,姣姣者漏学期的讨论,包孕蛋白酶K浓度,孵化时期在20~30分钟暗中。 ,甚至采取0.2mol/L HCL多功能的的% 胃蛋白酶。
(2)氧化醋酸高等突然转向。,提议在运用前在茶缓冲把加热到接近沸腾中混录氧化醋酸。。
(3)1×SSC = 150mmol/L NaCl,15mmol/L sodium citrate pH7.2。
原位杂交
(1)私生子 (40% 去水合氢甲酰胺、10% 葡多糖、1×Denhardt”s 、 Ficoll、 多线染体的γ-丁内酰胺(多线染体的γ-丁内酰胺)、10mg/ml去RNA 酶牛树液、4×SSC、10mmol/L DTT 、1mg/ml变性大剪刀鲑鱼受精卵DNA的配制品。(2)排水后用穿插缓冲把加热到接近沸腾冲洗。,一套周 边干,每张做切片滴加30μl探测杂交液(内含5-10ng非同位素指示牌cRNA探测)。(3)运用24×30mm混合盖(疏水) plastic 赘生物混合一套的防护塑性的罩。(4)42摄氏温度 湿箱睡。
关于注意事项:混合把加热到接近沸腾应新配制品。,和AT – 20 C 下存储器,这种新的混合气体可以运用各自的月。。
杂交后处置
(1)去除私生子,在2×SSC 5中浸泡做切片。 – 10min。(2) 在摄氏37度 用 2×SSC 2×15min、1×SSC 2×15min振荡冲洗。(3)移居非穿插单链RNA探测。,在摄氏37度 含RNA酶A NTE减震器(500毫鼹鼠/升) NaCl,10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,中漂30min。(4)37摄氏温度 用X SSC振荡洗涤2×30min。
关于注意事项
不要同时将明显的的探测放入同任何人货柜中。。(2)杂交安排高。,更多非假定臂板信号装置,可在52℃运用。 含5% 甲酰胺的2元SSC淋洗。
杂交后的色增长
(1)运用缓冲 A PH7.5(100mmol/L Tris-Hcl,150mmol/L NaCl)振荡冲洗段2×10min。(2) 每个做切片用40 L的封锁把加热到接近沸腾滴注。 (含% Triton X-100和2% 不变的绵羊树液缓冲把加热到接近沸腾 A PH7.5)。(3)甩掉封锁把加热到接近沸腾。,每个做切片混录抗异羟洋地黄毒苷对称体AKP缀合物30微米L。 (减震器) A内含% Triton X-100,1% 不变的羊树液, 山羊抗异羟洋地黄毒苷对称体AKP结合的在保温箱中2小时。。(4)运用缓冲 振荡冲洗参加2*10min。(5)运用缓冲 B PH9.5(100mmol/L Tris-Hcl,100mmol/L NaCl,50mmol/L MgCl 2 孵化部10 min。(6)显色液的配制品:用10ml Buffer B PH9.5,含45μL 硝酰四氮唑蓝(Nitroblue tetrazolium NBT)(75mg/ml NBT,70%二木精甲酰胺,35μl 5-溴-4-氯-3-氮茚基-汽水(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate BCIP)或X – Phosphate(50mg X – Phosphate/ml,100%二木精甲酰胺。(7) 每个参加是200升黑色传奇色彩receiver 收音机。,Chromogenic在傻子学期下2-24小时。。(8)色毫无疑问的后,运用减震器。 C PH8.1(10mmol/L Tris-Hcl,1mmol/L 乙二胺四醋酸) 水煮做切片。(9)DDH2O废除应唱圣歌。(10)用% 乙绿或% 谷粒红染中心1-2min。(11)用流水冲洗2×10min。。(12)运用GVA。 Mount)片剂用水溶性胶囊密封材料。。
关于注意事项
(1)显色液的配制品:10ml Buffer B PH5.5把加热到接近沸腾含45μL NBT(70% 两木精甲酰胺含75千分之一公分/千分之一升 NBT,35μl BCIP或X -汽水(100%) 两木精甲酰胺含50mg/ml X-汽水) ,1mmol/L左旋咪唑(左旋咪唑)(左旋咪唑) 西格玛光机株式会社)。
(2)抗异羟洋地黄毒苷对称体-AKP的姣姣者浓度可经过,用1:100、1:500和1:1000对称体浓度的比较地。
(3)假使1mmol/L左旋咪唑的浓度在上色把加热到接近沸腾中运用,内源性磷脂有生气的也较高(安排胶原) ,左旋咪唑的浓度可增加到5mmol/L。。
(4)NBT/BCIP上色液的横断面。,二甲苯不克不及用于透明的和使溶解二甲苯。。
(5)滴液和显色液应转移遗失。,更指示牌的做切片要平放。,执政的任何人要紧争辩是塑性的滑动。 有去污作用的度与有去污作用的度关于。。运用DAKO幻术的笔在一套四周一圈。,杂交应唱圣歌中可以疏忽杂交赘生物物。、也可以变坏色应唱圣歌。 转移应唱圣歌流动的溢流。

假使有些东西微暗,,你可以PM我。,我会尽量多的答复。。

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